متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته : زیست شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : بررسی مقایسه­ای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم ­توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم ­بوویس به روش  SDS-PAGE

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم و تحقیقات

 

پایان نامه کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی-میکروبیولوژی (M.Sc)

عنوان

بررسی مقایسه­ای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم ­توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم ­بوویس به روش  SDS-PAGE

استاد راهنما

دکتر احمد رضا بهرمند

 

مشاور

دکتر مهناز سیفی

 

سال تحصیلی 1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

 

فهرست مطالب

 

چکیده 1
فصل اول- مقدمه 3
1-1. کلیات سل 4
1-2. بیان مسئله 5
1-3. اهمیت و ضرورت 7
1-4. اهداف 8
فصل دوم- پیشینه تحقیق 9
2-1. تاریخچه 10
2-2. مایکوباکتریوم­ها 11
2-3. طبقه­بندی مایکو باکتریوم­ها 12
2-3-1. فتو کروموژن 13
2-3-2. اسکوتوکروموژن 13
2-3-3. غیر کروموژن 14
2-3-4. سریع الرشد 14
2-4. باکتریولوژی سل 14
2-5. مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی 15
2-6. خصوصیات رشد 16
2-7 . فیزیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 17
2-7-1. انتقال مواد غذایی توسط غشاء خارجی 18
2-7-2. انتقال توسط غشاء داخلی 18
2-7-2-1. انتقال ترکیبات حاوی کربن 18
2-7-2-2. انتقال ترکیبات غیر کربن 19
2-8. فاکتورهای ویرولانس 20
1-9. دیواره سلولی 21
2-10. بیوشیمی دیواره سلولی 23
2-11. بیماری­زایی 23
2-11-1. مکانیسم بیماری­زایی 25
2-12. درمان سل 26
2-12-1. درمان سل حساس به دارو 26
2-12-2. درمان سل مقاوم به دارو 26
2-13. مقاومت دارویی مایكوباكتریوم توبركلوزیس 27
2-14. مکانیسم مولکولی مقاومت دارویی 28
2-14-1. مقاومت به ریفامپین 28
2-14-2. مقاومت به ایزونیازید 29
2-14-3. مقاومت به پیرازین آمید 29
2-14-4. مقاومت به اتامبوتول 30
2-14-5. مقاومت به استرپتومایسین 30
2-14-6. فلورو کینولون­ها 30
2-14-7. آمینوگلیکوزیدها 31
2-14-8. سیکلوسرین 31
2-14-9. پاراآمینوسالیسیلیک 32
2-15. انواع سل 33
2-15-1. سل ریوی 33
2-15-2. سل خارج ریوی 33
2-15-2-1. سل عقده­های لنفاوی 33
2-15-2-2. سل پلور 34
2-15-2-3. سل استخوانی 34
2-15-2-4. سل سیستم عصبی مرکزی 34
2-15-2-5. سل شکمی 34
2-15-2-6. سل دستگاه تناسلی 35
2-15-2-7. سل پریکاردیت 35
2-15-2-8. سل ارزنی 35
2-16. سل در کودکان 36
2-17. سل و ایدز 36
2-18. روش­های تشخیص سل 37
2-18-1. تست پوستی 37
2-18-2. کشت 37
2-18-3. تهیه اسمیر 38
2-18-4. تکنیک PCR 38
2-18-5. بررسی اینترفرون گاما 38
2-18-6. رادیوگرافی ریه 39
2-19. اپیدمیولوژی 39
2-19-1. وضعیت بیماری سل انسانی در ایران 41
2-20. مایکوباکتریوم بوویس 44
2-20-1. اهمیت سل گاوی 45
2-21. مایکوباکتریوم بوویس ب.­ث.­ژ 45
2-21-1. فیلوژنی 45
2-21-2. تاریخچه BCG 48
2-21-3. تاریخچه تولید و مصرف واکسن ب.ث.ژ در ایران 50
2-21-4. ایمنی­زایی 51
2-21-5. لزوم طراحی واکسن جدید 52
2-22. پروتئومیکس مایکوباکتریوم­ها 53
2-23. پیشینه تحقیق پروتئومیکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس 58
فصل سوم- مواد و روش­ها 61
3-1. نمونه­گیری 63
3-2. کشت و جداسازی باکتری 64
3-2-1. مواد مورد نیاز برای تولید محیط لوون اشتاین جانسون به میزان 5/1 لیتر 64
3-2-2. طرز تهیه محیط کشت 64
3-2-3. آلودگی­زدایی و تغلیظ نمونه­ها 65
3-2-3-1. آماده سازی محلول­ها 66
3-2-4. روش کار کشت 66
3-2-4-1. محیط کشت حاوی تیوفن 2- کربوکسیلیک اسید هیدرازید 67
3-3. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریوم­ها 67
3-3-1. تهیه گستره 67
3-3-2. رنگ­آمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O 68
3-3-3. رنگ­آمیزی ذیل-­ نلسون 69
3-3-4. رنگ­آمیزی کینون (رنگ­آمیزی سرد) 70
3-3-5. بررسی و آزمایش گسترش 71
3-4. بررسی لوله­های کشت 71
3-5. شناسایی و تعیین­ هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس 72
3-5-1. تست نیاسین 77
2-5-1-1. معرف­ها و مواد لازم تست نیاسین 72
3-5-1-2. آماده­سازی محلولها ی نیاسین 72
3-5-1-3. مراحل کارتست نیاسین 73
3-5-2. آزمون­های احیای نیترات 73
3-5-2-1. معرف­ها و مواد لازم تست نیترات 73
3-5-2-2. آماده­سازی معرف­های تست نیترات 74
3-5-2-3. مراحل انجام کار تست نیترات 74
3-5-2-4. استاندارد­های احیاء نیترات 74
3-5-3. تست کاتالاز 75
3-5-3-1. محیط و مواد مورد نیاز 76
3-5-3-2. آماده­سازی محلولهای تست کاتالاز 76
3-5-3-3. مراحل انجام آزمایش روش نیمه کمی کاتالاز و کاتالاز 68 درجه 76
3-5-3-4. نتایج و تفسیر آزمایش کاتالاز 77
3-5-4. حساسیت به تیوفن 2- کربوکسیلیک هیدرازید (TCH) 77
3-6. آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریوم­ها 77
3-6-1. تهیه محلول استاندارد مک فارلند 78
3-6-2. تهیه سوسپانسیون باکتری 78
3-7. کشت سویه­های انتخابی در محیط میدل بروک 7H9 78
3-7-1. مواد مورد نیاز 78
3-7-1-1. آماده­سازی محیط 78
3-7-1-2. انتحاب سویه­ها و کشت 80
3-8. جمع­آوری سویه­ها میکروبی، استخراج و خالص­سازی پروتئین 80
3-8-1. استخراج پروتئین­های غشایی 80
3-8-1-1. مواد مورد نیاز 80
3-8-1-2. تهیه بافر و محلول­ها 80
3-8-1-3. روش کار 81
3-8-1-4. استخراج پروتئین­های ترشحی 81
3-8-2. خالص­سازی پروتئین 81
3-8-2-1. مواد مورد نیاز 81
3-8-2-1-1. آماده­سازی محلول­ها و مواد 81
3-8-2-1-2. روش کار ترسب پروتئین­های غشایی 83
3-8-2-1-3. ترسیب پروتئین­های ترشحی 83
3-8-2-2. تعیین غلظت پروتئین­ها 84
3-8-2-2-1.  مواد مورد نیاز 84
3-8-2-2-2. آماده­سازی محلول­ برادفورد 85
3-8-2-2-3. روش کار 85
3-9. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید(تک بعدی) 85
3-9-1. مواد مورد نیاز 86
3-9-2. آماده­سازی مواد 86
3-9-3. روش کار 88
3-9-3-1. رنگ­­آمیزی کوماسی بلو R-250 90
3-9-3-2. رنگ­آمیزی Blue Silver Staining 90
3-10. تصویر برداری و آنالیز ژل­ها 90
فصل چهارم- نتایج 91
4-1. جمعیت مورد مطالعه 92
4-2. درصد سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جمع­آوری شده از بیماران با توجه به موضع جداسازی 93
4-3. مشاهده لام رنگ­آمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O 93
4-4. مشاهده لام رنگ­آمیزی ذیل-نلسون 94
4-5. نتایج کشت­ها 94
4-6. آزمون­های بیوشیمیایی وحساسیت آنتی­بیوتیکی 95
4-7. نتایج تعیین غلظت پروتئین­ها 97
4-8. نتایج مربوط به تفکیک پروتئین­ها بر اساس وزن مولکولی 98
فصل پنجم- بحث و نتیجه گیری 102
پیشنهاد 108
منابع 109
چکیده انگلیسی 117
   

 

فهرست نمودارها

 

2-1: میزان بروز بیماری سل در طول 46 سال گذشته در ایران 41
4-1: نتایج کشت مثبت 92
4-2: منحنی استاندارد 98

 

فهرست جداول

 

2-1:  تاکسونومی اعضای کمپلکس توبرکلوزیس 15
2-2: داروهای خط دوم درمان توبركلوزیس 32
2-3: تخمین موارد ومتوسط میزان بروز سل در جهان در سال2010 40
2-4: به تفکیک دانشگاه­های علوم پزشکی کشور 42
2-5: برخی تغییرات ژنی در سویه­های BCG  M. bovis 47
3-1: نحوه گزارش میکروسکوپی 71
3-2: مواد تشکیل­دهنده بافرتخلیص 81
3-3: مواد تشکیل­دهنده محلول PBS x10 83
3-4: مواد تشکیل­دهنده محلول برادفورد 85
3-5: مواد تشکیل­دهنده Running Buffer 10% 86
3-6: مواد تشکیل­دهنده Coomassie Gel stain 87
3-7: مواد تشکیل­دهنده Coomassie Gel Destain 87
3-8: مواد تشکیل­دهنده Fixation solution 87
3-9: مواد تشکیل­دهنده Stainining solution 88
3-10: مواد تشکیل­دهنده ژل 10%,12.5%   Separating 89
3-11: مواد تشکیل­دهنده ژل  Stacking 5% 89
4-1: درصد نمونه­های بالینی 93
4-2: نتایج تست­های بیوشیمیایی 96
4-3: نتایج تست­های حساسیت آنتی­بیوتیکی و  TCH 97
فهرست تصاویر
2-1: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در مومیایی، به­دلیل بیماری سـل 11
2-2: عکس­برداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 16
2-3: کلنی­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون 17
2-4: نمای شماتیک ازساختمان دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 22
2-5: میزان بروز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس درنقاط مختلف جهان در سال 2012 40
2-6: درخت تبارشناسی زیرسویه­های مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگی آن­ها و خصوصیات مولکولی 46
2-7: برخی از عکس­های تاریخی مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ 49
3-1: مرحله دیالیز 84
3-2: آماده­سازی صفحات شیشه­ای 88
4-1: باسیل اسید فست در رنگ امیزی اورامین 93
4-2: باسیل اسید فست در رنگ امیزی ذیل-نلسون 94
4-3: فاکتور طنابی (cord factor) 95
4-4: تفسیر تست نیترات 95
4-5: باندهای پروتئین­های غشایی سویه­های M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% و رنگ آمیزی آمیزی کوماسی بلو R-250 99
4-6: باندهای پروتئین­های غشایی سویه­های M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10%  رنگ آمیزی Blue Silver Staining 100
4-7: باندهای پروتئین­های ترشحی سویه­های M. bovis و M. TB 101
5-1: تصویر A سویهM. tuberculosis H37Rv  و تصویرB سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس 106
 

 

چکیده

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل می­باشد. از زمانی که سازمان جهانی بهداشت در سال 1993، توبرکلوزیس را به عنوان یک فوریت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دلیل وجود سوش­های مقاوم به درمان و تداخل با بیماری ایدز دچار مشکل شده است. مایکوباکتریوم بوویس به عنوان عامل سل گاوی به صورت موردی انسان را نیز درگیر می کند و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب می­شود. مبارزه با این آلودگی امروزه باعث گسترش بررسی آنتی­ژن­های باکتری به منظور دسترسی بیومارکرهای موثر در تشخیص، اهداف دارویی و اجزای واکسن مورد اهمیت واقع شده­­اند.

جهت مقایسه پروفایل پروتئینی سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس به درمان و مایکوباکتریوم بوویس از کل نمونه­های ارسالی 6 ماهه اول سال 1392 به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، 100 نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا نمونه­های کلینیکی با روش ان استیل- ال سیستئین- هیدروکسید سدیم و در محیط کشت لونشتاین جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مایکوباکتریوم بوویس از سایر مایکوباکتریوم­ها، از تستهای بیوشیمیایی (نیترات، کاتالاز، نیاسین و TCH) و حساسیت آنتی بیوتیکی استفاده شد. کلونی­ها در محیط میدل بروک 7H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونی­های جدید، به منظور استخراج پروتئین­های ترشحی و غشایی از روشهای سونیکاسیون، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و الکل استفاده گردید و به وسیله روش برادفورد تعیین غلظت شد  و در نهایت مقایسه با روش الکتروفورز تک بعدی انجام پذیرفت.

با بررسی باندهای حاصله از پروتئین­های غشایی و ترشحی در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس هیچگونه تفاوتی مشاهده نشد و همچنین در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم بوویس نیز تفاوتی مشاهده نشد. در سویه­های مایکوباکتریوم بوویس، برای پروتئین­های غشایی باندهایی در محدوده 15 تا 85 کیلودالتون مشاهده شد و در سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس نیز باندهای از 15 تا 120 کیلودالتون مشاهده شد این دو سویه در محدوده­های وزنی تقریبا 30 تا 116 کیلو دالتون بسیار متفاوت بوده­اند.

در بررسی پروتئین­های ترشحی در سویه­های مایکوباکتریوم بوویس، باندهایی در محدوده 15 تا 115 کیلودالتون و در سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس باندهایی از 18 تا 114 کیلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزنی کمی در این محدوده­ها مشاهده شد.

نتایج حاصل از تفکیک باندهای پروتئینی سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس، حاکی از شباهت نسبی با سویه استانداردM. tuberculosis H37Rv  نسبت به مطالعات دیگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهای حاصله از هر دو نوع پروتئین­های سویه­های مایکوباکتریوم بوویس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس می­تواند مرجعی برای بررسی­های بیشتر پروتئومیکس در باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و بوویس باشد.

به نظر می­رسد اختلاف بیان باندهای پروتئینی سویه­های حساس و بوویس با به کارگیری روشهای مناسب می­تواند به عنوان پروتئین مارکر و یا حتی بیومارکر موثر در تشخیص سویه­های حساس و بوویس از یکدیگر، اهداف دارویی و اجزای واکسن قابل استفاده باشد.                       

فصل اول

مقدمه

1-1. کلیات سل

سل بیماری است که از دیرباز در بین جوامع مختلف شیوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسان­های عصر حجر و استخوان­های مومیایی شده مصریان باستان جدا کرده­اند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه یكی از بزرگترین مسائل بهداشتی جهان، بیماری سل است. حدس زده میشود كه از هر سه نفر جمعیت جهان، یك نفر به باسیل سل آلوده بوده و درهر ثانیه یك نفر به تعداد آنان افزوده می­شود. نگران كننده این است كه طبق برآوردهای موجود 50 میلیون نفر از این افراد، به باسیل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر 12 میلیون نفر درجهان به بیماری سل مبتلا هستند كه بیش از 80% این موارد، تنها مربوط به 22 كشور درحال توسعه جهان است.

در سال 2010 میلادی، حدود 8/8 میلیون نفر جدید به سل فعال مبتلا شده و حدود 1/1 میلیون نفر در اثر این بیماری جان می­سپارند. بیش از 90% موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در كشورهای در حال توسعه رخ می­دهد، كشورهایی كه 75% موارد بیماری در آنها به فعال­ترین گروه سنی به لحاظ اقتصادی (یعنی 15 تا 54 سالگی) تعلق دارد.

آلودگی هم­زمان به ویروس ایدز خطر ابتلا به بیماری سل را به طور معنا داری افزایش می­دهد. كشورهای با شیوع بالای HIV، به ویژه كشورهای واقع در افریقای زیر صحرا، شاهد افزایش چشمگیر تعداد بیماران مبتلا به سل و افزایش 2 تا 3 برابر میزان­های بروز گزارش شده سل در دهه 90 بوده­اند. در سال 2010، میزان شیوع عفونت اچ آی وی در میان بیماران مبتلا به سل در جهان 13% تخمین زده شده است (W.H.O., 2010).

سل یک بیماری تنفسی است که راه عمده سرایت آن ذرات تنفسی[1] وخلط سینه بیماران[2] می­باشد. اما  روش­های سرایت دیگری همچون تلقیح مستقیم باسیل سل در پوست مجروح کسانی که با بافت آلوده سروکار دارند نیز توصیف شده است. ورود باسیل سل به بدن یک فرد ضرورتا ایجاد بیماری سل نمی­کند، اولین فاکتورهای افزایش دهنده امکان ابتلاء فرد آلوده شده، خصوصیات شخصی هر فرد (مانند سن، جنس، ساختمان بدن و حساسیت ژنتیکی)، عوامل اجتماعی (مانند فقر غذایی و شرایط زیستی) و عواملی نظیر سرکوب سیستم ایمنی[3] ناشی از داروهای استروئیدی یا بیماری­هایی نظیر سرطان خون، بیماری­های دستگاه رتیکولواندوتلیال، دیابت شیرین[4]، بیماری­های قارچی سیستمیک و ایدز[5] می­باشد (Jonas  V. et al., 1993).

کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTB) [6]که شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس[7]، افریکانوم[8]، بوویس[9]، بوویس[10]BCG، کاپره­ای[11]، میکروتی(mycobacterium microti)، پنی­پدی،  dassie bacillusو کانتی (mycobacteriu canettii)، گرچه خصوصیات فنوتیپی متفاوتی در تست­های بیوشیمیایی از خود نشان می­دهند اما همولوژی بالایی به لحاظ ژنتیکی دارند  .(Somoskovi A. et al., 2007)افتراق اعضای کمپلکس توبرکلوزیس برای پیشبرد درمان موفق ضروری است بالاخص در مناطقی که بیماری به صورت اپیدمیک در می­آید یا تماس انسان و حیوان زیاد است  .(Barouni A.S. et al., 2004)

همان­طور که ذکر شد M. bovis یکی از قدیمی­ترین و مهمترین عامل بیماری سل بین انسان و دام (Zoonoses) و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب می­شود. میزان مرگ و میر ناشی از  M. bovis بیشتر از M. tuberculosis می­باشد .(Majoor C.J. et al., 2011)  تشخیص M. bovis و M. bovis BCG  از دیگر اعضای کمپلکس MTB بدلیل مقاومت ذاتی (Scorpio A. et al., 1997)  آنها به آنتی بیوتیک پیرازینامید[12] از اهمیت راهبردی برخوردار است  .(Jure´en P. et al., 2008)این در حالی است که مقاومت به پیرازینامید در مایکوباکتریوم­های غیر کمپلکس MTB عمومیت ندارد .(Sun Z. et al., 1997)  پیرازینامید جزو داروهای خط اول مقابله با بیماری سل و قادر به از بین بردن  باکتری­های غیر فعال و احتمالا داخل سلولی است. این خصوصیات امکان کاهش زمان درمان از ۱۲-۱۸ ماه به ۶ ماه را امکان­پذیر می­کند (Lee K.W. et al., 2001).

روش­های کلاسیک افتراقM. tuberculosis  و M. bovis و تست­های حساسیت به دارو بر پایه­ی احیای نیترات[13]، فعالیت آنزیم پیرازینامیداز (Pyrazinamide)، تجمع نیاسین و رشد در محیط تیوفن ۲-کربوکسیلیک اسید هیدرازید[14] استوار است  .(Monteros L. et al., 1998)

تعداد صفحه : 116

قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        *       asa.goharii@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

 

دسته‌ها: زیست شناسی