دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی 

گرایش : فيزيولوژي جانوري

عنوان : بررسي اثر عصاره برگ زيتون و ترکيب اصلي آن(اولئوروپئين) بر سميت سلولي ناشي از 6-هيدروکسي دوپامين در سلول­هاي PC12

 دانشگاه شهید باهنر کرمان

گروه زيست شناسي

 پايان نامه تحصيلي براي دريافت درجه کارشناسي ارشد زيست شناسي

گرايش فيزيولوژي جانوري

بررسي اثر عصاره برگ زيتون و ترکيب اصلي آن(اولئوروپئين) بر سميت سلولي ناشي از 6-هيدروکسي دوپامين در سلول­هاي PC12

 اساتيد راهنما:

دکتر سعيد اسماعيلي ماهاني

دکتر وحيد شيباني

استاد مشاور:

دکتر مهدي عباس نژاد

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکيده:

بيماري پارکينسون يک اختلال تخريب کننده نوروني شديد و پيش رونده سيستم عصبي مرکزي است که يکي از شايع ترين اختلالات حرکتي مي­باشد. براي اکثر بيماري‌هاي تخريب کننده عصبي اقدامات موجود حکم مسکن را دارند. به علت اينکه شواهد متعددي پيشنهاد مي­کنندکه دربسياري از بيماري‌هاي تخريب کننده نوروني مرگ سلولي غير عادي رخ مي­دهد، داروهايي که بتوانند مرگ سلولي را متوقف کنند ممکن است از تخريب نوروني بيشتر جلوگيري کرده و پيشرفت بيماري را آهسته کنند. ترکيبات عمده عصاره برگ زيتون فنول هايي مانند اولئوروپئين مي­باشند، که آثار ضد آپوپتوزي از خود نشان مي­دهند بنابراين، مطالعه حاضر جهت بررسي اثر عصاره برگ زيتون و اولئوروپئين بر سميت سلولي ناشي از 6-هيدروکسي دوپامين بر روي سلول‌هاي PC12  به عنوان مدل in vitro بيماري پارکينسون طراحي شد. جهت القاء سميت سلولي، سلول‌هاي PC12 با 150 ميکرومول 6-هيدروکسي دوپامين تيمار شدند. در گروه­هاي درماني دوزهاي متفاوت برگ زيتون(g/mlμ600-100) واولئوروپئين(g/mlμ25-5) جهت بررسي اثر احتمالي محافظت کننده آنهااستفاده شد. سميت سلولي توسط تست MTT تعيين شد. ميزان ROS داخل سلولي توسط پروب فلورسنس دي­کلرو فلورسين دي استات از طريق روش فلوريمتري ارزيابي شد. قطعات DNA وپارامترهاي بيوشيميايي آپوپتوز (Bax, Bcl2  و caspase3) به ترتيب توسط الکتروفورز در ژل آگارز و ايمونوبلاتينگ ارزيابي شدند. نتايج ما نشان دادند که افزايش 6-هيدروکسي دوپامين منجر به افزايش ميزان آسيب سلولي، توليد  ROS داخل سلولي، فعال شدن کاسپاز3، قطعه­قطعه شدن DNA و همچنين افزايش نسبت Bax/Bcl2  مي­گردد. تيمار با عصاره برگ زيتون(μg/ml 400و600) و اولئوروپئين ( μg/ml20و25)  اختلالات ذکر شده را کاهش مي­دهد. روي هم رفته نتايج پيشنهاد مي­کنند که عصاره برگ زيتون و اولئوروپئين در برابر آپوپتوز القاء شده در اثر 6-هيدروکسي دوپامين اثر محافظت کننده نوروني دارند. حداقل بخشي از اين اثر محافظت کننده به واسطه کاهش آپوپتوز نوروني اعمال مي­گردد و پيشنهاد کننده پتانسيل دارويي عصاره برگ زيتون و اولئوروپئين براي کاهش تخريب عصبي سلول­هاي دوپامينرژيک مي‌باشد.

کلمات کليدي:عصاره برگ زيتون، 6-هيدروکسي دوپامين، آپوپتوز، سلول­هايPC12، اولئوروپئين.

فهرست مطالب:

 فصل اول… 1

1-1    معرفي بيماري  پارکينسون. 2

1-2    فاکتورهاي دخيل در بيماري پارکينسون. 4

1-2-1  افزايش سن.. 4

1-2-2  فاکتور هاي محيطي.. 4

1-3    سيستم يوبي کوئيتين پروتئوزوم 16

1-3-1  فاکتورهاي ژنتيکي دخيل دربيماري پارکينسون. 17

1-4    التهاب عصبي و بيماري پارکينسون. 21

1-4-1  نقش فعال شدن گليال ها در بيماري پارکينسون. 22

1-4-2  تغييرات ريز محيط ها در بيماري پارکينسون. 23

1-5    معرفي گياه زيتون. 23

1-5-1  خصوصيات شيميايي عصاره برگ زيتون. 24

1-6    اولئوروپئين  به عنوان ترکيب اصلي برگ زيتون. 28

فصل دوم.. 30

2-1    مواد و روشها 31

2-1-1  وسايل مورد استفاده. 31

2-1-2  مواد و داروهاي مورد استفاده. 31

2-1-3  بافرها و محلولهاي مورد استفاده. 32

2-2    جمع آوري برگ زيتون. 34

2-3    تهيه عصاره برگ زيتون. 34

2-4    کشت سلول. 35

2-5    سنجش بقاي سلولي. 35

2-5-1  MTT assay  35

2-6    سنجش ROS داخل سلولي. 37

2-6-1  گروه‌هاي مورد استفاده در تست ROS. 38

2-7    استخراج DNA از سلول‌هاي PC12 39

2-7-1  گروه‌هاي مورد آزمايش جهت استخراج DNA 40

2-8    الكتروفورز قطعات DNA.. 41

2-8-1  گروه‌هاي مورد آزمايش در وسترن بلات… 41

2-8-2  استخراج پروتئين از سلول‌هاي PC12 42

2-8-3  اندازه گيري کل پروتئين.. 43

2-8-4  بررسي ميزان پروتئينهاي درگير در آپوپتوز (Bax, Bcl-2, Caspase 3) با بهره گرفتن از روش وسترن بلات    44

2-8-5  الکتروفورز پروتئينها روي ژل  SDS-PAGE.. 44

2-8-6  انتقال از ژل به کاغذ  PVDF. 45

2-8-7  بلاکينگ     46

2-8-8  مرحله شستشو. 46

2-8-9  اضافه کردن آنتي بادي اوليه. 47

2-8-10            اضافه کردن آنتي بادي ثانويه. 47

2-8-11            افزودن سوبسترا و ثبت باندهاي نوراني روي فيلم راديولوژي.. 47

2-8-12            ظهور فيلم.. 48

2-8-13            زدودن آنتي باديهاي متصل به آنتي ژن از روي کاغذ و کنترل لودينگ نمونه ها 48

2-8-14            آناليز تصاوير گرفته شده از باندهاي پروتئيني.. 49

2-9    آناليز آماري. 49

فصل سوم.. 50

3-1    نتايج. 51

3-1-1  بررسي تأثيرات غلظتهاي متفاوت 6-هيدروکسي دوپامين بر بقاي سلول‌هاي PC12. 51

3-1-2  بررسي اثرات دوزهاي متفاوت عصاره بر سلول‌هاي PC12 52

3-1-3  بررسي اثرات دوزهاي متفاوت اولئوروپئين بر سلول‌هاي PC12 53

3-1-4  بررسي اثرات دوزهاي متفاوت عصاره برگ زيتون(OLE) بر بقاي سلول‌هاي  PC12کشت شده در حضور 6-هيدروکسي دوپامين.. 54

3-1-5  بررسي اثرات دوزهاي متفاوت اولئوروپئين بر بقاي سلول‌هاي  PC12کشت شده در حضور 6-هيدروکسي دوپامين   55

3-1-6  بررسي اثرات دوزهاي موثر عصاره برگ زيتون بر ميزان توليد ROS داخل سلولي ناشي از 6-هيدروکسي دوپامين   56

3-1-7  بررسي اثرات دوزهاي موثر اولئوروپئين بر ميزان توليد ROS داخل سلولي ناشي از 6-هيدروکسي دوپامين   57

3-1-8  آناليز نتايج به دست آمده از وسترن بلات براي پروتئينهاي درگير در آپوپتوز سلولي.. 58

3-1-9  بررسي اثرات عصاره برگ زيتون واولئوروپئين بر قطعه قطعه شدن DNA ناشي از 6-هيدروکسي دوپامين   63

فصل چهارم.. 64

4-1    بحث و نتيجه گيري. 65

4-2    بروز استرس اکسيدايتو وآپوپتوز در بيماري پارکينسون. 65

4-3    عملکرد کانال هاي کلسيم و بيماري پارکينسون. 72

4-4    بروز التهاب نوروني در بيماري پارکينسون. 73

4-5    نتيجه گيري کلي. 76

4-6    پيشنهادها 77

1-1      معرفي بيماري  پارکينسون:

بيمار ي پارکينسون يک اختلال تخريب کننده عصبي است که به عنوان دومين بيماري تخريب کننده عصبي رايج در بين افراد پس از بيماري آلزايمر مي‌باشد . ميزان شيوع اين بيماري درافراد بالاي 50 سال حدوداً 2 درصد است(1).

پارکينسونيسم يا پارکينسون ثانويه در اثر مسموميت با منگنز، مسموميت با مونوکسيدکربن، ضربه مزمن و مداوم به سر  و برخي مواد مخدر تزريقي ممکن است ايجاد گردد که علائمي مشابه با پارکينسون دارد. اولين گزارشات مربوط به پارکينسونيسم به 5000 سال قبل از ميلاد در هندوستان بر مي‌گردد تا اينکه در سال 1817 دکتر جيمز پارکينسون اولين گزارشات مربوط به بيماري پارکينسون را ارائه داد(2).

بيماري پارکينسون همراه با اختلالات حرکتي مي‌باشد که مي توان به سفتي عضلاني ، لرزش در حال استراحت، آکينزي يا مشکل در شروع حرکات، کاهش حرکات خود بخودي و برادي کينزي يا آهسته بودن حرکات، ضعف در حفظ تعادل، کاهش حرکات وابسته يعني حرکات ناخود آگاه طبيعي بدن مانند تغيير حالات چهره به هنگام صحبت کردن اشاره کرد(3).

بيماري پارکينسون توسط از دست دادن 50 تا 70 درصد نورون هاي دوپامينرژيک بخش متراکم جسم سياه مشخص مي‌گردد. علاوه بر نورون هاي دو پامينرژيک ساير جمعيت هاي نوروني نيزکه شامل بخشهايي از لوکوس سرلئوس[1] (نورآدرنرژيک)، هسته هاي رافه[2] (سروتونرژيک)،هسته هاي ماينرت[3] و هسته حرکتي پشتي واگ[4] (کولينرژيک)، قشر سينگوليت[5]، قشر اينتورينال[6]، پياز بويايي[7] و گانگليون هاي سمپاتيک و پاراسمپاتيک در روده نيز متاثر مي‌گردند. تخريب برخي از اين نواحي غير دوپامينرژيک با علائم ثانويه بيماري پارکينسون از قبيل اختلالات شناختي، غير حرکتي، خواب واتونوميک مرتبط مي‌باشند(4).

يکي از نظريه هايي که در مورد علت بيماري پارکينسون مطرح است اين است که اين بيماري ناشي از يک عدم تعادل بين تحريک و مهار در عقده هاي قاعده اي در اثر مهار دوپاميني پوتامن مي‌باشد. در نتيجه، خروجي مهاري از پوتامن به قطعه خارجي گلوبوس پاليدوس افزايش يافته و منجر به کاهش خروجي مهاري از گلوبوس پاليدوس خارجي به هسته زير تالاموسي مي‌گردد که اين امر به نوبه خود موجب افزايش خروجي تحريکي به قطعه داخلي گلوبوس پاليدوس از هسته زير تالاموسي مي‌گردد. افزايش تحريک گلوبوس پاليدوس داخلي باعث افزايش مهار تالاموس شده، در نتيجه خروجي تحريکي از تالاموس کاهش يافته  و در اثر کاهش تحريک قشر اختلالات کم حرکتي بروز مي‌يابند(3).

علاوه  بر تخريب نورون هاي دو پامينرژيک بخش متراکم جسم سياه از ديگر علامت هاي بيماري پارکينسون وجود يکسري تجمعات سيتوپلاسمي داخل نوروني که به اجسام لوي معروف اند مي‌باشد. اجسام لوي اولين بار توسط فردريش لوي در سال 1912 معرفي شدند که به صورت يکسري تجمعات کروي ائوزينوفيلي سيتوپلاسمي متشکل از تعدادي پروتئين مانند آلفا سينوکلئين[8]،  پارکين[9] ، يوبي کوئيتين[10] ، سين فيلين[11] و نوروفيلامنت[12] مي‌باشند. ضخامت اجسام لوي حدوداً 15 ميکرومتر است و در نواحي مغزي متاثر مي‌گردند(5).

اجسام لوي علاوه بر بيماري پارکينسون در ساير بيماري ها مانند آلزايمر و در افراد سالم نيز با افزايش سن ديده مي‌شوند. علي رغم وجود اجسام لوي در حالات بيماري ، نقش اجسام لوي در مرگ سلول‌هاي عصبي نامشخص است و جاي بحث دارد. اگر چه اين تجمعات پروتئيني به علت  اختلال در فرايند هاي سلولي طبيعي يا مصادره کردن پروتئين هايي که براي بقاي سلولي مهم اند ممکن است  براي نورون ها سمي باشند، احتمال ديگر اين است که اجسام لوي ممکن است با به­دام انداختن پروتئين‌هاي مضرر در تجمعات پروتئيني محافظت کننده باشند(4).

1-2      فاکتورهاي دخيل در بيماري پارکينسون:

فاکتور هاي دخيل در بيماري پارکينسون منجر به اختلال در عملکرد ميتوکندريايي، استرس اکسيداتيو و فعال شدن مسيرهاي آپوپتوزي مي‌گردند که در نهايت باعث تخريب نورون هاي دوپامينرژيک مي‌گردند(6).

اين فاکتورها عبارتند از :

1-افزايش سن

2-فاکتورهاي محيطي

3-فاکتورهاي ژنتيکي

1-2-1     افزايش سن:

در افراد طبيعي با افزايش سن ميزان دوپامين و تعداد رسپتور هاي آن در داخل عقده هاي قاعده اي به طور دائم کاهش يافته و ظاهراً اين تسريع درکاهش موجب بروز بيماري پارکينسون مي‌گردد(7).

1-2-2    فاکتور هاي محيطي:

اگر چه اکثر موارد بيماري پارکينسون غير ارثي اند اما منشاء آن‌ها به ميزان زيادي نامشخص باقي مانده است. مطالعات اپيدميولوژيک مشخص کرده است که فاکتور هاي محيطي در آسيب تخريب کننده عصبي نقش مهمي ايفا مي‌کنند.  براي مثال مطالعات اپيدميولوژيک حاکي از اين است که قرار گرفتن در معرض آفت کش ها، فلزات، بي فنيل پرکلرات، برخي حلال ها و برخي مواد ويژه ديگر خطر ابتلا به بيماري پارکينسون را افزايش مي‌دهند(8). فاکتورهاي محيطي آسيب رسان توسط سه مکانيسم استرس اکسيداتيو ايجاد مي‌کنند:

1-القاء توليد ROS[13] 

2- تغيير متابوليسم ميتوکندريايي

3- تغيير سيکل اکسيداسيون احياء(9)

استرس اکسيداتيو  توسط عدم تعادل بين توليد گونه­هاي واکنش پذير اکسيژن و توانايي غيرسمي کردن متابوليت هاي فعال توليد شده و ترميم آسيب­هاي ايجاد شده مشخص مي‌گردد. گونه­هاي واکنش پذير اکسيژن ياROS شامل راديکال‌هاي آزاد مشتق از اکسيژن (مولکول‌هاي داراي يک يا تعداد بيشتري الکترون جفت نشده در خارجي ترين لايه والانسي) مانند آنيون سوپراکسيد، راديکال هيدروکسيل و همچنين مشتقات غير راديکالي اکسيژن مانند هيدروژن پراکسيد مي‌باشند(10).

منابع توليد ROS  متعددي داخل سلول وجود دارند. يکي از  توليد کننده‌هاي  اصلي ROS خانواده اي از آنزيم‌هاي متصل به غشاء که جهت فعاليت­شان متکي به NADPH[14] مي‌باشند. منبع ديگر توليد اکسيد کننده‌هاي داخل سلولي ميتوکندري مي‌باشد، شواهد زيادي وجود دارند که پيشنهاد مي‌کنند اکسيد کننده‌هاي ميتوکندريايي غالباً در کمپلکس I وIII زنجيره تنفسي ميتوکندري شکل مي­گيرند. علاوه بر ميتوکندري و NADPH اکسيداز منابع ديگر توليد ROS داخل سلولي نيز، موجودند مانند گروهي از آنزيم‌هاي داخل سلولي شامل گزانتين­اکسيداز[15]، سيکلواکسيژناز[16]، آنزيم سيتوکروم 450P و ليپواکسيژناز[17]که به عنوان بخشي از فعاليت آنزيمي طبيعي­شان اکسيدکننده­ها را نيز توليد مي‌کنند(11).

آنيون سوپر اکسيد توليد شده توسط اين اکسيدکننده­ها با نيتريک اکسيد حاصل از فعاليت نيتريک اکسيد سنتاز منجر به شکل گيري طيف وسيعي از اکسيدکننده­ها و نيترات­کننده­ها مانند پراکسي نيتريت مي‌گردند. آنيون سوپر اکسيد همچنين به کمک سوپر اکسيد دسموتاز توسط فعاليت آنزيمي يا غير آنزيمي تبديل به هيدروژن پراکسيد مي‌گردد. هيدروژن پراکسيد همچنين مي‌تواند توسط ميلو پراکسيداز (MPO[18]) هيپوکلروس­اسيد و ساير اکسيدکننده‌هاي مضر مشتق از کلر را توليد کند. بعلاوه از طريق واکنش فنتون[19] تبديل به يون هيدروکسيل گردد.

بنابراين شکل گيري يک گونه واکنش پذير مي‌تواند نهايتاً منجر به تقويت يک زنجيره توليد کننده از ساير گونه هاي واکنش پذير سمي گردد(10).

سلول ها داراي مکانيسم‌هاي آنتي اکسيداني ذاتي اند که ROS توليد شده تحت هر دو شرايط فيزيولوژيکي و پاتولوژيکي را سميت زدايي مي‌کنند.گلوتاتيون احياء شده[20](GSH) مهمترين مولکول آنتي اکسيدان سلول است و به علت غلظت سيتوزولي بالايش مي‌تواند مستقيماً ROS هايي مانند آنيون سوپراکسيد، هيدروکسيل و نيتريک اکسيد را از سلول بزدايد. هيدروژن پراکسيد توسط کاتالاز و گلوتاتيون پراکسيداز (GPX) به آب احياء مي‌گردد. سيستم گلوتاتيون ردوکتاز[21](GR) و تيوردوکسين ردوکتاز[22](TRX)، گلوتاتيون و تيورودوکسين اکسيد شده را با مصرف NADPH دوباره احياء مي‌کنند. ساير مولکول‌هاي آنتي اکسيدان مانند آسکوربات  يا ويتامين E و آنزيم هايي مانند پراکسي ردوکسين[23] در برابر استرس اکسيداتيو حمايت هاي مهمي محسوب مي‌گردند(12).

پراکسيداسيون ليپيد ها اشاره به تخريب اکسيد کننده ليپيد ها دارد که طي آن به واسطه گرفتن اتم هيدروژن از اسيدهاي چرب غير اشباع آب و يک راديکال اسيد چرب توليد مي‌گردد، راديکال‌هاي اسيد چرب آزاد نيز با آب واکنش داده و راديکال‌هاي ليپيد پراکسيل توليد مي‌گردد که نهايتاً با ساير راديکال‌هاي اسيد چرب آزاد واکنش داده و باعث افزايش آسيب مي‌گردد.

تغييرات اکسيداتيو پروتئين‌ها طيف وسيعي از فعاليت هاي کينازي، فسفاتازي، پروتئازي، چاپرون ها و فاکتورهاي رونويسي را تحت تاثير قرار مي‌دهد. اسيد هاي آمينه مانند سيستئين، متيونين، تريپتوفان و تيروزين در برابر تغييرات اکسيد کننده بسيار حساس اند(13).

1-2-2-1   آفت­کش ها و بيماري پارکينسون:

آفت­کش ها تنها روي گونه هدفشان موثر نيستند بلکه اثراتي روي ساير گونه هاي غير هدف مانند انسان نيز دارند. سميت آفت کش ها به وضوح مشخص شده است که طيف وسيعي از فعاليت هاي فيزيولوژيکي را تغيير مي‌دهند، بعلاوه شواهد موجود بيان مي‌کنند که قرار گرفتن در معرض آفت کش ها همچنين خطر ابتلا به سرطان و بيماري‌هاي تخريب کننده عصبي را افزايش مي‌دهند(14).

تعداد صفحه :105

قیمت : 14700تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

:        ****       serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***

جستجو در سایت : کلمه کلیدی خود را وارد نمایید :
 
 

1 Comment

Comments are closed.