دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته  دامپزشکی 

عنوان : انتشار فیلوژنتیکی جدایه های اشریشیاکلی واجد ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین

دانشگاه شهید باهنر کرمان

دانشکده دامپزشکی

 موضوع:

  انتشار فیلوژنتیکی جدایه های اشریشیاکلی واجد ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین در مدفوع بلدرچین های سالم 

اساتید راهنما:

دکتر رضا قنبرپور

دکتر محمود صالحی

استاد مشاور:

دکتر  محمد خلیلی

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

خلاصه فارسی

دسته ای از سویه های اشریشیاکلی که قابلیت بیماری زایی در بلدرچین را ندارند اما از جنبه بهداشت عمومی با اهمیت تلقی می شوند سویه های تولید کننده شیگاتوکسین می باشند. هدف از این مطالعه شناسایی گروه و تحت گروه های فیلوژنی و تعیین حضور ژن های شیگاتوکسین و اینتیمین در جدایه های اشریشیاکلی از مدفوع از بلدرچین های سالم بوده است. در این مطلعه 235 نمونه مدفوع از بلدرچین سالم جمع آوری شده و متعاقبا جداسازی و تعیین هویت بیوشیمیایی سویه های اشریشیاکلی انجام گردید. از تمامی نمونه های اخذ شده از باکتری اشریشیاکلی جدا شد و اسیدنوکلئیک از جدایه ها استخراج گردید. جدایه های طی دو روش مولتی پلکس PCR مورد بررسی قرار گرفتند. بر اساس نتایج آزمایش PCR معلوم گردید که 235 جدایه مورد آزمایش در 4 گروه فیلوژنی انتشار دارند که بیشترین فراوانی مربوط به گروه A (55/62 درصد) و کمترین فراوانی مربوط به گروه B2 (90/8 درصد) بوده است. از طرف دیگر 9 جدایه (83/3 درصد) نسبت به یکی از ژن های stx1، stx2 و eae مثبت بوده اند. بیشترین فراوانی مربوط به ژن eae ( 13/2 درصد) بود همچنین 3 جدایه (28/1 درصد ) دارای ژن stx2 و یک جدایه (43/0 درصد ) نیز واجد ژن stx1 بود. نه جدایه ی (83/3 درصد) مثبت از نظر ژن های قابل بررسی در چهار گروه فیلوژنی A ، B1، B2 و D انتشار داشتند. تنها جدایه ی مثبت از نظر ژن stx1 در گروه فیلوژنی D قرار داشت سه جدایه ی مثبت از نظر ژن stx2 در دو گروه فیلوژنیD, A انشتار داشت. پنج جدایه ی مثبت از نظر ژن eae در چهار گروه فیلوژنی A ، B1، Dو B2 قرار اشتند از نظر آنتی بیوگرام بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به اکسی تتراسایکلین بود که 234 جدایه (57/99 درصد ) نسبت به این آنتی بیوتیک مقام بوده. بعد از  تتراسایکلین بیشترین میزان مقاومت مربوط به آمپی سیلین بود که 160 جدایه (09/68 درصد) نسبت به این آنتی بیوتیک مقاوم بودند.  کلمات کلیدی: اشریشیاکلی، بلدرچین ، شیگاتوکسین، فیلوژنی

 فهرست مطالب

خلاصه فارسی………………………………………………………………………………………………….

فصل اول:  مقدمه و هدف

مقدمه و هدف ……………………………………………………………………………………………….0

فصل دوم: کلیات و مروری بر منابع موجود

1-2- کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ((STEC اشریشیاکلی………………….5

1-1-2- وروتوكسين ها يا توكسين هاي شبيه شيگا  …………………………………………………………..5

2-1-2-  ژنتيك وروتوكسين    ………………………………………………………………………………………7

3-1-2- ساختمان وروتوكسين ها  ………………………………………………………………………………….8

4-1-2- ناهمگونی سویه های تولید کننده شیگاتوکسین   ………………………………………………….10

5-1-2- نامگذاری سویه های تولید کننده شیگاتوکسین  …………………………………………………..11

6-1-2-  اپیدمیولوژی پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین…………………………………………………..12

7-1-2- منابع انتشار سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ………………………………………………….

15 2-2- کلیاتی در مورد بلدرچین  ………………………………………………………………………..16

1-2-2- تاریخچه  ……………………………………………………………………………………………………..17

2-2-2-  شروع پرورش در جهان   ……………………………………………………………………………….17

3-2-2- شروع پرورش در ایران  ………………………………………………………………………………….18

4-2-2- جانور شناسی  ……………………………………………………………………………………………….19

5-2-2- نژادهای بلدرچین  ………………………………………………………………………………………….19

6-2-2- ویژگیهای عمومی بلدرچین  …………………………………………………………………………….21

7-2-2- جنبه های اقتصادی………………………………………………………………………………………….24

8-2-2- نکاتی در مورد شروع صنعتی پرورش  ……………………………………………………………….25

9-2-2- وسایل مورد نیاز برای نگهداری جوجه های بلدرچین   …………………………………………28

10-2-2- تغذیه بلدرچین  …………………………………………………………………………………………..30

11-2-2-  فراوری و بسته بندی گوشت و تخم بلدرچین ها   ……………………………………………..32

3-2- کلیاتی در مورد بیماری های بلدرچین   ………………………………………………………………….34

1-3-2- کلی باسیلوز در بلدرچین و طیور  ……………………………………………………………………..35

2-3-2- اشکال دیگر کلی باسیلوز در طیور  …………………………………………………………………..41

3-3-2- بیماری نیوکاسل  …………………………………………………………………………………………..42

4-3-2 -آنفلوانزا ……………………………………………………………………………………………………….45

5-3-2- برونشیت بلدرچین ………………………………………………………………………………………….46

6-3-2- بیماری آسپرژیلوز ………………………………………………………………………………………….50

فصل سوم: مواد  و روش کار

1-3- مواد و وسایل مورد استفاده  …………………………………………………………………………………54

2-3- روش‌کار  ………………………………………………………………………………………………………..55

1-2-3- جمع آوری و تقسیم بندی نمونه‌ها  ……………………………………………………………………55

2-2-3- كشت نمونه‌ها و جدا سازی اشریشياکلی  ……………………………………………………………55

3-2-3- تأیید نمونه‌هاي اشریشیاکلی   …………………………………………………………………………..56

4-2-3- ذخیره نمونه‌ها  ………………………………………………………………………………………………56

5-2-3- آزمایش PCR  …………………………………………………………………………………………….57

1-5-2-3- استخراج DNA  ………………………………………………………………………………………57

2-5-2-3- آزمایش PCR جهت شناسایی ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین   ……………57

3-5-2-3-  آزمایش PCR جهت تعیین گروه و تحت گروه فیلوژنی  …………………………………59

4-5-2-3-  شناسایی و آنالیز محصولات PCR  ……………………………………………………………..61

1-4-5-2-3- مراحل انجام الکتروفورز  …………………………………………………………………………61

3-3- تعيين حساسيت آنتي‌بيوتيكي  ………………………………………………………………………………64

فصل چهارم: نتایج

1-4- تعیین درصد جدایه های اشریشیاکلی در گروه های فیلوژنی   …………………………………….67

2-4- انتشار جدایه ها از مدفوع بلدرچین در تحت گروههای فیلوژنی  …………………………………68

3-4- نتیجه آزمایش PCR جهت شناسایی ژن های eae ، stx1 وstx2  ……………………………70

4-4- انتشار فیلوژنی جدایه های اشریشیاکلی مثبت از نظر stx1 ،eae و stx2   ……………………71

5-4- تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه ها  …………………………………………………………………73

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………….. 76

پیشنهادات  …………………………………………………………………………………………………………………..

منابع …………………………………………………………………………………………………………………….83

خلاصه انگلیسی  …………………………………………………………………………………………………..90

باکتری اشریشیاکلی بطور معمول در دستگاه گوارش پستانداران و پرندگان وجود دارد.سویه های بيماریزا، در شرایط استرس محیطی و تضعیف سیستم ایمنی باعث ایجاد کلی‌باسیلوز[1] در طیور می‌شوند. سویه های بیماریزا همچنین باعث ایجاد بیماریهای گوارشی و عفونت دستگاه ادراری در انسان می شوند. سويه‌هاي بيماریزاي اشریشیاکلی طيور[2]‌‌‌‌ (APEC) بصورت عادي جزء ميكروفلور طبيعي دستگاه گوارش طيور مي‌باشند و ممكن است در سطوح مخاطي حيوانات اهلي و وحشي نيز يافت شوند. حدود 10 تا 15 درصد از کلی‌فرم[3]‌‌های روده، مربوط به سروتيپ‌هاي بيماریزا[4] می‌باشد. مي‌توان سروتيپ‌هاي بيماريزا را همراه با سروتيپ‌هاي غير بيماريزا[5] از محيط اطراف طيور جدا كرد. عفونت با سويه‌هاي APEC غالباً با عفونت‌هاي خارج گوارشي به ويژه عفونت‌هاي تنفسي و يا سيستميك همراه است.

در بلدرچین سویه های اشریشیاکلی  بیماریزا غالبا متعلق به گروههای سرمی O15,O4,O9,O38,O42,O88 و برخی سروگروههای دیگر می باشند. سروگروههای مذکور از موارد سپتی سمی کلی باسیلی، سلولیت و موارد مرگ جنینی جدا شده اند (10). بلدرچین به عنوان یک میزبان برای کلی باسیلوز شناخته می شود و پرورش دهندگان آن از این بابت خسارات زیادی را متحمل می شوند.

در کشور ما بعد از انقلاب، برای اولین بار پرورش بلدرچین[6] در استان یزد آغاز گردید که به صورت مجتمع شامل واحدهای مادر، گوشتی، بسته بندی و جوجه کشی اداره می‌گردد. وجود ویژگی‌های مناسب همچون رشد سریع، بلوغ زودرس، تولید تخم بالا، کوتاهی فاصله میان نسل‌ها، بالابودن تراکم پرورشی در واحد سطح، حساسیت کم نسبت به بعضی از بيماري‌های طیور، قیمت بالای تولیدات که شامل گوشت و تخم می‌باشد و به خصوص بازگشت سریع سرمایه سبب شده است تا بلدرچین به عنوان یک پرنده مطلوب نزد کشاورزان و پرورش دهندگان تلقی شده و علاقمندان زیادی به پرورش صنعتی این پرنده روی آورند. بلدرچین دارای گوشتی با پروتئین بالا و درصد چربی کم می‌باشد که برای کودکان و بیماران بسیار سودمند و مفید می‌باشد.

پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین  (STEC) اشریشیاکلی عامل  بروز کولیت هموراژیک با منشا مواد غذائی در انسان است. امروزه سویه های STEC به عنوان گروهی از عوامل مسبب بیماریهای مشترک انسان و دام شناخته شده و خصوصا در کشورهای در حال توسعه بیماری های قابل توجهی در انسان ایجاد می کنند  که شامل کولیت های هموراژیک و سندرم اورمی
می باشند. اخیرا مشخص شده که این سویه ها ممکن است در دامها و طیور سالم هم حضور داشته باشند. مهمترین عامل بیماریزایی این سویه ها، تولید شیگاتوکسین است که از مدفوع طیور و حیوانات سالم به محیط ،آب و غذا منتقل شده و باعث بیماری در انسان می گردد. سویه های STEC قادرند دو نوع شیگاتوکسین Stx1   و Stx2  را تولید نمایند. مطالعات  اندکی در زمینه سویه های STEC جدا شده از طیور ، انجام شده است. از طرف دیگر  آنالیز فیلوژنتیکی باکتری اشریشیاکلی نشان داده است که سویه های مختلف این باکتری در 4 گروه فیلوژنتیکی شامل A ,B1 B2 , وD  قرار دارند.

 از آنجائیکه تاکنون مطالعه فیلوژنتیکی بر روی سویه های اشریشیاکلی STEC جدا شده از بلدرچین وجود ندارد، لذا هدف از انجام این پایان نامه جدا سازی اشریشیاکلی از مدفوع
بلدرچین های سالم و شناسائی سویه های واجد  ژن های کد کننده شیگا توکسین و انتیمین
 (Stx1 و  (eae, Stx2 و  تعیین گروه فیلوژنتیکی اشریشیاکلی به روش PCR می باشد.

1-2 کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین [7]((STEC اشریشیاکلی

کشف پاتوتیپ اشریشیاکلی های تولید کننده  شیگا توکسین (STEC) از زمانی آغاز شد که گروهی از دانشمندان گزارش کردند که مایع فیلتر شده ی کشت تعدادی از سویه های مختلف اشریشیاکلی برای سلولهای ورو[8]  سایتوتوکسیک کشنده بوده و این فعالیت کشندگی سلول با آنتی سرم انتروتوکسین  [9] اشریشیاکلی های شبه کلرای کلاسیک خنثی نمی شد. متعاقباً آنالیز 136 سویه  اشریشیاکلی آشکار ساخت که 10 مورد از این سویه ها قادر به تولید این سیتوتوکسین سلول های ورو [10]هستند. بعد از اخذ این نتایج، اهمیت حضور سویه های اشریشیاکلی O26  تولید کننده سیتوتوکسین درارتباط با اسهال خونی مشخص شد در سال 1983 ارتباطی بین یک سروتیپ نادر از اشریشیاکلی (O157:H7) والتهاب کولون خونریزی دهنده [11]  گزارش شد. در همان سال گروهی از محققین ارتباط بین حضور شیگاتوکسین تولید شده توسط اشریشیاکلی و بروز سندرم یورمی انسان را مطرح کردند. این مشاهدات باعث توجه قابل ملاحظه ای به پاتوتیپ STEC شد و از آن زمان  تاکنون بیش از 200 تیپ مختلف اشریشیاکلی گزارش شده اند که شیگاتوکسین تولید می کنند و تعداد زیادی از آنها با بیماری های انسان ارتباط دارند(4)

1-1-2 وروتوكسين ها يا توكسين هاي شبيه شيگا

از نظر تاريخچه در سال 1977 كنوالجوك[12] ، كلمه وروتوكسين را براي سيتوتوكسين اشريشياكلي بكار برد در يك مطالعه كه برروي 136 سويه اشريشياكلي انجام گرفت، 7 مورد از 10 سويه اي كه وروتوكسين توليد مي كردند با بيماري اسهال انساني و يك مورد از آنها با اسهال خوكها ارتباط داشتند. در يك مطالعه مقدماتي در سال 1977 و مورد كامل آن در سال 1982، گزارش گرديد كه سويه هاي خاصي از ETEC، سيتوتوكسيني را توليد مي كنند كه براي سلولهاي هلا[13] كشنده است همانند توكسين شيگا اين سيتوتوكسين نيز از سنتز پروتئيني در سلول هاي هلا ممانعت مي كند و از طرف ديگر در روده خرگوش اثرات آنتروتوكسيك داشته و براي موش نيز كشنده است، به همين دليل اين سيتوتوكسين را توكسين شبيه شيگا نام نهادند. در سال 1983 SLT خالص گرديد و نشان دادند كه توكسين شيگا توليد شده بوسیله شيگلاديسانتريه و SLT توليد شده بوسيله اشريشياكلي ازنظر خصوصيات فيزيكوشيميايي و فعاليت هاي بيولوژي مشابهند (22).

در سال 1977 طي مطالعه اي مشخص گرديد كه وروتوكسين توليد شده بوسيله يك سويه خوكي و يك سويه انساني، بوسيله آنتي سرم خاص وروتوكسين سويه ديگر خنثي نمي شود و بدنبال آن، دو گروه آنتي ژني وروتوكسين كشف گرديد و آنها را VT2 , VT1 يا SLT-I و SLT-II ناميدند و متعاقب آن انواع SLT كه با SLT-II مرتبط بودند شناسايي گرديد مطالعات بعدي نشان داد كه SLTها متعلق به دو گروه هستند که  گروه اول از نظر پادگني فقط يك نوع داشته و تحت عنوان VT-1 يا SLT-1 ناميده مي شود و فعاليت آن بوسيله آنتي سرم توكسين شيگا خنثي مي گردد و گروه دوم SLT، شامل ساير وروتوكسين هاست كه شامل گروهي است كه از نظر آنتي ژني، با هم ارتباط نزديكي دارند و فعاليت سيتوتوكسيك اين گروه بوسيله آنتي سرم ضد SLT-I و آنتي باديهاي ضدتوكسين شيگا خنثي نمي شود. در اعضاء‌گروه دوم واريانتي از SLT-II كه آن را  با SLT-II يا VTe نشان مي دهند وجود دارد كه در بيماري ادمي خوك دخالت دارد. SLT-II به اين دليل واريانتي  از SLT-II ناميده مي شود كه، برخلاف ‌SLT-II برروي سلول هاي هلا اثر نداشته يا تاثير كمتري دارد (37). البته SLT-IIa نيز واريانت ديگري است كه از موارد اسهال نوزادان جدا شده است اين توكسين بوسيله اشريشياكلي O128 توليد مي گردد (34 و 22).

 2-1-2 ژنتيك وروتوكسين

در ابتدا مشخص گرديد كه ژنهاي وروتوكسين ها مربوط به باكتريوفاژهاي معتدل[14] بوده و متعاقب آن ژنهاي SLT-I اين باكتريوفاژها كلون گرديد و توالي نوكلئوتيدهاي آن تعيين شد اپرن SLT-I، دوچارچوب خواندن[15] را شامل مي شود كه يكي براي كد كردن تحت واحد A و ديگري براي تحت واحد كوچك B بكار مي رود.

مقايسه توالي نوكلئوتيدي SLT-II نيز در اشريشياكلي با SLT-I نشان مي دهد كه در مشابهت توالي نوكلئوتيدها ژنهاي ساختماني براي دوتوكسين در تحت واحد A 57% و در تحت واحد B، 60% مي باشد (34).

همچنان كه قبلا گفته شد در گروه دوم SLT چندين نوع SLT-II وجود دارد و ژنهاي هر كدام از آنها نيز مطالعه شده و با ساير SLTها مقايسه گرديده است ولي براي جلوگيري از طولاني شدن مبحث از توضيح آنها خودداري مي گردد.

3-1-2 ساختمان وروتوكسين ها

ساختمان تحت واحدهاي SLT بخاطر مشابهت آن با توكسين شيگا براحتي مطالعه شده و ساختار آن كاملا مشخص شده است كه به كمك اطلاعات بدست آمده از توالي نوكلئوتيدها و همچنين خالص سازي توكسين اين امر ميسر گرديده است. SLTها از دو تحت واحد تشكيل شده اند كه تحت واحد A  تقريبا 33 كيلودالتون و تحت واحدB حدود 5/7 كيلودالتون وزن دارد. تعداد تحت واحد B مشابه توكسين شيگا 5 تا بوده و در اتصالSLT به رسپتور گليكوليپيدي نقش دارد.

از نظر فعاليت بيولوژي، تمامي وروتوكسين ها براي سلول هاي ورو (Vero) سمي بوده و براي موش كشنده اند همچنين براي خرگوش آنتروتوكسيك اند اين توكسين مانع از سنتز پروتئين شده و كمتر از يك ساعت بعد از در معرض قرار گرفتن سلول، قابل تشخيص است.  وروتوكسين ها براي سلول هاي اندوتليال عروقي نيز سمي بوده و علائمي كه در بيماري بروز مي كند مربوط به تاثير توكسين برروي اين بافت ها است.

موشي كه مورد تزريق اين توكسين قرار گيرد قبل از مرگ، دچار فلجي اندام خلفي مي شود كه اين حالت احتمالا بعلت آسيب به سيستم اعصاب مركزي است كه بعدا منجر به مرگ حيوان مي گردد.  در خرگوش و خوك نيز كانون هاي گسترده هموراژي در عروق وادم مغزي ديده مي شود كه در اثر SLT ايجاد شده و ضايعات مغزي منجر به مرگ حيوان مي شود (20).

از نظر مكانيسم عمل،‌هر دو توكسين SLT-I و SLT-II در نتيجه فعاليت N-RNA گليكوزيدازي مانع از سنتز پروتئين در سلول هاي اكاريوت مي گردند. وروتوكسين ها باعث شكستن پيوند خاص N- گليكوزيدي در RNA ريبوزمي s28 شده و در نتيجه آن يك باقيمانده آدنيني آزاد مي شود و در نهايت سنتز پروتئيني صورت نمي گيرد.

از نظر اثرات بيماريزايي، سويه هاي توليد كننده اين توكسين كه تحت عنوان VTEC [16] ناميده مي شوند در انسان سه سندرم ايجاد مي كنند كه عبارتند از اسهال، كوليت هموراژيك و سندرم اورمي هموليتيك(HUS)[17] (28)

اورمي هموليتيك با علائمي نظير ناتواني حاد كليوي[18] ، ترمبوسيتوپني[19] و آنمي هموليتيك[20] و اسهال توام است.

تعداد صفحه :105

قیمت : 14700تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

:        ****       serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***

جستجو در سایت : کلمه کلیدی خود را وارد نمایید :
 
 

1 Comment

Comments are closed.