متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :کشاورزی

عنوان :تاثیر نور فرابنفش روی ویژگی­های رشد و ترکیبات فنلی در کشت کالوس مرزه خوزستانی (Satureja Khuzistanica JAMZAD)

 

دانشگاه آزاد اسلامی

گروه کشاورزی

عنوان

تاثیر نور فرابنفش روی ویژگی­های رشد و ترکیبات فنلی در کشت کالوس مرزه خوزستانی (Satureja Khuzistanica JAMZAD)

پژوهش و نگارش:

 

استاد راهنما

 

استاد مشاور

 

رساله برای دریافت درجه کارشناسی ارشد (M.SC)

رشته علوم باغبانی گرایش بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی محصولات باغبانی

 

تابستان 1395

 

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده:

گیاه مرزه خوزستانی(Satureja khuzistanica jamzad)

متعلق به خانواده نعناعیان (Lamiaceae) وزیر خانواده نپتوییده (nepetoideae) که 12 گونه از این جنس در ایران وجود دارد به تقریب 8 گونه آن بومی و منحصر به ایران می باشد. این گیاه به دلیل داشتن رزمارینیک اسید بالا، فعالیت بیولوژیکی بالایی داشته  و در صنایع دارویی، غذایی و عطر سازی کاربرد آن رو به گسترش می باشد. از ویژگی های این گیاه رویش در مناطق با اقلیم مرطوب خاک های عمیق و مناطق خشک، آفتابی و خاکهای سنگلاخی می باشد. در این مطالعه مقدار رزمارینیک اسید، فنل کل، ویژگی های رشدی کالوس مرزه خوزستانی مورد بررسی قرار گرفت. مقدار رزمارینیک اسید از 11/1 تا 11/5 میلی گرم در 100 میلی گرم ماده خشک متغییر بود. تیمارهای 2 ساعت نور فرابنفش، شاهد و 10 دقیقه نورفرابنفش به ترتیب با مقادیر 533/5 ، 450/3 و 263/3 دارای بالاترین مقدار رزمارینیک اسید بودند.

تیمار 4 ساعت نورفرابنفش بیشترین میزان فنل کل و 2 دقیقه نور فرا بنفش کمترین میزان  فنل کل را دارا بودند. همچنین در بررسی صفات مرفولوژیکی تیمار شاهد بیشترین میزان را نشان می داد. نتایج نشان می دهد که کالوس های مرزه خوزستان با قرار گرفتن در معرض نور فلوئورسنت رشد  بهتری دارند علت آن هم تولید ترکیبات فنلی توسط کالوس در نور می باشد که این ترکیبات با اکسیده شدن تولید مواد سمی برای رشد کالوس می کنند. تنش نور فرا بنفش A با افزایش توتال فنل و رزمارینیک اسید نشان داد. این تنش می تواند به عنوان یک الیسیتور در تولید ترکیبات فنلی به کاربرده شود.

واژگان کلیدی: مرزه خوزستانی، نورفرا بنفش، فنل کل، رزمارینیک اسید.

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                        شماره صفحه

 

فصل اول. 1

1-بیان موضوع وهدف. 2

1-1-ضرورت انجام تحقیق. 2

2-1- استفاده از الیسیتورها و ایجاد شرایط تنش در جهت تحریک تولید ترکیبات. 4

1-2- فرضیه‏های مطرح شده جهت انجام تحقیق. 6

1-3- اهداف کلی تحقیق: 6

فصل دوم. 8

2- تاریخچه استفاده ازگیاهان دارویی. 9

2-1- سوابق علمی دررابطه باتولید متابولیت های ثانویه از طریق کشت درون شیشه ای. 12

2-2- سوابق علمی در ارتباط با تولید رزمارینیک اسید از طریق  کشت های درون شیشه ای. 13

2-2-1- انواع کشت بافت. 13

2-2-2- انواع كشت در شرایط درون شیشه ای. 13

2-3- معرفی گیاه مرزه. 14

2-3-1- تاریخچه. 14

2-4- معرفی خانواده نعناعیان:. 15

2-4-1- جنس مرزه. 18

2-4-2-دامنه گسترش  مرزه خوزستانی. 20

2-4-3- محل تولید و ترشح اسانس های گیاهی. 20

2-4-3-1-بیوسنتز اسانس ها. 21

2-4-4- مشخصات فیتوشیمیایی گونه های جنس مرزه. 21

2-4-4-1- اساس ژنتیکی و اکولوژیکی بیوسنتز ترپن های فنلی کارواکرول و تیمول. 23

2-4-4-2- کارواکرول. 25

2-4-4-3- رزمارینیک اسید:. 25

2-4-4-3-1- مسیر بیوسنتز رزمارینیک اسید:. 25

2-4-4-3-2-  خواص دارویی رزمارینیک اسیدوسایرترکیبات فنلی:   27

2-4-4-4- ترکیبات فنلی، ساختار، سنتز وعملکرد درگیاهان   29

2-5- تاریخچه آنتی اکسیدان. 30

2-5-1- آنتی اکسیدان. 31

2-5-2- مکانیسم آنتی‌اکسیدان. 31

2-5-3- طبقه‌بندی آنتی‌اکسیدان‌ها. 32

2-5-3-1- سینرژیست‌ها و آنتاگونیست‌ها. 32

2-5-3-2- آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی. 33

2-5-3-2-1 توکوفرول‌ها. 34

2-5-3-2-2- کاروتن‌ها. 34

2-5-3-2-3- اسیدهای فنلی. 34

2-5-3-2-4- فلاونوئیدها. 35

2-5-3-2-5- تانن. 35

2-5-3-2-6- ترپنوئیدها. 36

2-5-3-2-7- اسیدهای آمینه، پپتیدها و هیدرولیزای پروتئین   36

2-5-3-2-8- فیتات‌ها. 37

2-5-3-2-9- فسفولیپیدها. 37

2-5-3-2-10- ویتامین‌ها و آنزیم‌ها. 37

2-6- تعیین ترکیبات فنلی درگونه های مختلف مرزه. 37

2-6-1- اهمیت ترکیبات فنلی و رابطه آن با خاصیت آنتی اکسیدانی   37

2-6-2- الیسیتور. 40

2-7-1- اثرات پرتوفرابنفش درگیاهان. 42

2-7-2- شناسائی محلهای هدف تشعشعات فرا بنفش. 43

2-7-3- محل اثرفرابنفش در گیاهان: 44

2-7-4- روش های مقابله گیاه با پرتو فرابنفش:. 45

2-5-7- تحقیقات انجام شده بر تاثیر فرابنفش در گیاهان   47

6-7-2- مروری بر پژوهش ها ی انجام شده درجنس مرزه. 50

2-7-7- تحقیقات انجام شده در خانواده نعناعیان. 52

2-7-8- تحقیقاتی درباره با تولیدات رزمارینیک اسید   54

فصل سوم. 56

3-1- استانداردها ومواد مورد استفاده. 57

3-1-1- تهیه محلول استاندارد رزمارینیک اسید. 57

3-1-2- تهیه محلول گالیک اسید. 57

3-2- دستگاه ها و وسایل مورد استفاده. 57

3-2-1- هود لامینار. 57

3-2-1- مشخصات فنی هود لامینار کلاس II 58

3-2-2-سانتریفیوژ:. 58

3-2-3- اتوکلاو. 59

3-2-4- اچ پی تی ال سی : سیستم کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا. 61

3-2-5- التراسونیک. 62

3-2-6- لوکس متر. 63

3-2-7- PHمتر. 63

3-2-8- فریزدرایر. 64

3-2-9- لامپ یووی A.. 64

3-2-10- اتاقک رشد. 64

3-2-11- دستگاه اسپکتروفوتومتر. 65

3-3- بررسی کالوس زایی و معرفی بهترین شرایط مؤثربررشد کالوس های مرزه خوزستانی. 67

3-1-1- تهیه کالوس های مرزه خوزستانی. 67

3-3-2- تهیه محیط کشت  جهت واکشت کالوس های  مرزه خوزستانی   67

جدول 3-1 محلول های  پایه جهت تهیه محیط  کشت . 67

3-3-3- کشت کالوس ها در تیمارهای نوری مختلف. 69

3-3-4- شدت نوری در اتاقک کشت وانواع لامپ های فرابنفش استفاده شده   69

3-3-5- اندازه گیری ویژگی های رشدی  کالوس های مرزه خوزستانی در تیمارهای نوری مختلف. 70

3-3-6- سنجش اول : اندازه گیری میزان رزمارینیک اسید در تیمارهای نوری مورد بررسی. 71

3-3-6-1- روش های مورد استفاده. 71

3-3-6-2- اعمال تیمارهای نوری. 71

3-3-6-3- اندازه گیری وزن تر و خشک. 71

3-3-6-4-استخراج و عصاره گیری. 71

3-3-6-5- اندازه گیری رزمارینیک اسید. 72

3-3-7- سنجش دوم. 74

3-3-8- بررسی آماری. 74

فصل چهارم. 75

4-1 بررسی تغییرات مروفولوژیکی کالوس تحت تیمارهای نوری مختلف   76

4-1-1- اندازه گیری وزن ترکالوس. 76

4-2-1- اندازه گیری وزن خشک کالوس. 77

4-3-1- اندازه گیری درصد سرعت رشد نسبی کالوس. 78

4-3-2- اندازه گیری درصد رطوبت نسبی کالوس. 78

4-2- بررسی تغییرات فیتوشیمیایی کالوس مرزه خوزستانی تحت تیمارهای نوری. 80

4-2-1- اندازه گیری رزمارینیک اسید. 80

4-2-2- اندازه گیری فنل کل. 81

4-3- منحنی استاندارد اسید گالیک. 83

4-4- نمودارهای مربوط به کروماتوگرام HPTLC. 83

فصل پنجم. 88

5-1 نتیجه گیری کلی. 89

5-2 پیشنهادها. 90

منابع. 91

 

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                        شماره صفحه

شکل (2-1)، پراکندگی جغرافیایی مرزه خوزستانی در دو استان خوزستان و لرستان 20

شکل (2-2)، ساختار برخی از ترکیبات مهم جنس مرزه 23

شکل (2-3)، ساختار شیمیایی تیمول و کارواکرول (مونوترپن های تک حلقه ای) 25

شکل (2-4)، ساختمان شیمیایی رزمارینیک اسید   26

شکل (2-5)، مسیر بیوسنتز رزمارینیک اسید 26

جدول (2-1)، مثالهایی از گیاهان دارویی ضد درد( ایران) 58

شکل (3-1)، هود لامینار 59

شکل (3-2)، سانتریفیوژ 60

شکل (3-3)، اتوکلاو 61

شکل (3-4)، تانک حاوی کاغذ سیلیکاژل 61

شکل (3-5)، اچ پی تی سی ال 62

شکل (3-6)، اولتراسونیک. 63

شکل (3-7)، پی اچ متر 64

شکل (3-8)، لامپ یووی A 71

شکل (3-7)، لکه گذاری روی  کاغذ سیلیکاژل 74

شکل (4-1)، نمودار ستونی مقایسه میانگین وزن تر در تیمارهای نوری مختلف. 75

شکل (4-2)، نمودار ستونی مقایسه وزن خشک در تیمارهای نوری  مختلف. 76

شکل (4-3)، نمودار مقایسه میانگین درصد سرعت نسبی در تیمارهای نوری مختلف 77

شکل (4-4)، نمودار ستونی مقایسه میانگین درصد رطوبت نسبی تیمارهای نوری  مختلف 78

شکل (4-5)، نمودار ستونی مقایسه میانگین رزمارینیک اسید و  تیمارهای نوری  مختلف 79

شکل (4-6)، نمودار ستونی مقایسه میانگین فنل کل در تیمارهای نوری  مختلف 81

شکل (4-7)، کروماتوگرام HPTLC مربوط به تیمار شاهد 81

شکل (4-8)، کروماتوگرام HPTLC مربوط به تیمار 5 دقیقه نور فرابنفش 82

شکل (4-9)، کروماتوگرام HPTCL مربوط به تیمار 4 ساعت نورفرابنفش 82

شکل (4-10)، کروماتوگرام  مربوط به تیمار 2 ساعت نورفرابنفش 83

شکل (4-11)، کروماتوگرام HPTCL مربوط به تیمار 2 دقیقه نور فرابنفش 83

شکل (4-12)،کروماتوگرام HPTLC مربوط به تیمار تاریکی 84

شکل (4-13)، کروماتوگرام HPTLC مربوط به تیمار 10 دقیقه نورفرابنفش 84

 

 

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                        شماره صفحه

جدول (2-1)، مثالهایی از گیاهان دارویی ضد درد( ایران) 28

جدول (3-1)، محلول های  پایه جهت تهیه محیط  کشت . 65

جدول (4-1)، تجزیه واریانس اثر تیمارهای نوری بر صفات فیتوشیمیایی 83

جدول (4-2)، تجزیه واریانس اثر تیمارهای نوری بر صفات مرفولوژیک 84

                                                                      

 

 

فصل اول

مقدمه و هدف


 

1-بیان موضوع وهدف

1-1-ضرورت انجام تحقیق

طی چند دهه اخیر فناوری زیستی[1] با بهره گرفتن از راهكارهایی نظیر كشت سلول، اندام و بافت ها، مهندسی ژنتیك و كاربرد نشانگرهای مولكولی قادرشده  است كارآیی و بهره وری گیاهان دارویی را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد. كشت سلول، بافت ها و اندام های گیاهی امكان تكثیر سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم را فراهم نموده است استفاده از کشت های درون شیشه[2] به عنوان ابزار تولید ترکیبات دارویی دارای تاریخچه طولانی است. از زمانی که کشت بافت و کشت سلول ابداع شدند، محققین سعی نمودند  از این تکنیک ها جهت تولید ترکیبات ارزشمند زیستی و مطالعه چرخه های بیوسنتز آنها استفاده نمایند در این میان ترکیبات آنتی اکسیدان به واسطه توجه خاصی که به آنها وجود دارد مورد بررسی قرار گرفتند در دهه های اخیر مشخص گردیده که تنش های اکسیداتیو سبب بروز بسیاری از بیماریهای ناشی از افزایش سن می باشد و مطالعات زیادی در جهت تولید ترکیبات آنتی اکسیدان انجام شده است.

آنتی اکسیدان ها ترکیباتی هستند که قادرند با اثرات مضر اما طبیعی فرآیند فیزیولوژیک اکسیداسیون در بافت ها مقابله کنند. در واقع این ترکیبات قادرند تنش های اکسیداتیو را خنثی کرده یا به تأخیر بیاندازند حتی اگر غلظت و مقدارشان کمتر از عوامل اکسیدکننده باشد، به نظر می رسد این ترکیبات در جلوگیری از ایجاد بیماریهایی مانند سرطان ، بیماری قلبی ، آلزایمر و ... نقش دارند. در تحقیقات فراوانی خواص آنتی اکسیدانی اسانس های گیاهی همچون مرزه ، میخک، آویشن و ... مشخص گردیده است. بسیاری از آنزیم ها و ترکیباتی با وزن مولکولی کم همچون توکوفرول[3] ، گلوتاتیون[4]و ... نقش آنتی اکسیدانی دارند. گروه های دیگری از مواد مؤثره گیاهان دارویی همچون فلاونوئیدها نیز عملکرد مشابهی را از خود نشان داده اند. با توجه به قوانین سازمان بهداشت جهانی[5] که بر استفاده از آنتی اکسیدان های طبیعی تأکید دارند. امروزه تولید آنها اولویت خاصی پیدا کرده است یکی از نقش های مهم متابولیت های ثانویه[6] محافظت گیاه از آثار زیان آور و تنش های محیطی است. تولید متابولیت های ثانویه که دارای نقش آنتی اکسیدانی هستند در جهت جلوگیری از فعالیت گونه های واکنشگر اکسیژنی(ROS)است که در اثر تنش ها به وجود می آیند . بنابراین با استفاده بهینه از تنش ها می توانیم در جهت افزایش تولید ترکیبات آنتی اکسیدان قدم برداریم تنش های محیطی می توانند شامل تابش اشعه ماوراءبنفش ، خشکی ، صدمات فیزیکی و ... باشند تابانیدن تشعشعات ماوراءبنفش بر روی کالوس های گیاه گل ساعتی سبب افزایش تولید فلاونوئیدها گردید علت این پدیده این است که فلاونوئیدها در گیاه نقش حفاظت کنندگی در برابر تشعشعات مضر مثل فرابنفش را دارند.

(مروری بر تولید ترکیبات آنتی اکسیدان در شرایط درون شیشه دومین جشنواره و نمایشگاه ملی گیاهان دارویی1394) کشت های درون شیشه به دلیل ویژگی هایی که دارند به عنوان یکی از راهکارهای تولید این ترکیبات در نظر گرفته شده اند. البته با وجود تلاش هایی که در30 سال اخیر جهت تولید درون شیشه ترکیبات دارویی انجام شده است تنها مقدار کمی از آنها تاکنون به مرحله تجاری سازی رسیده اند

   تکنیک کشت بافت[7] طی چند دهه گذشته به عنوان ابزاری کارآمد در ریزازدیادی، تکثیر، اصلاح و تولید گیاهان در شرایط کنترل شده درون شیشه ای در مراکز تحقیقاتی سراسر دنیا مورد استفاده قرار می گیرد. در واقع کشت بافت گیاهی را نمی توان شاخه ای مجزا از علومی نظیر ژنتیک، فیزیولوژی، باغبانی و غیره به شمار آورد بلکه کشت بافت ابزار مناسبی در خدمت سایر علوم بوده و به آنها در دستیابی به اهداف مورد نظر کمک می کند. در زمینه گیاهان دارویی نیز علاوه بر کاربرد آن در ریزادیادی، تکثیر، تولید و حفاظت از گیاهان دارویی باارزش و در خطر انقراض، طی دو دهه اخیر به عنوان ابزاری موثر برای تولید متابولیت های ثانویه در شرایط کنترل شده نیز مطرح می باشد. این آزمایش تلاش می کند تا با مطالعه مسیرهای بیوسنتزی متابولیتهای ثانویه در گیاهان دارویی، انتقال ژن و دخالت در بیوسنتز این ترکیبات، بهینه سازی تولید آنها در کشتهای کنترل شده سوسپانسیون سلولی[8] و ریشه مویینه[9] را تا مرحله نیمه صنعتی مورد مطالعه قرار دهد. از دلایل رویکرد به تولید ترکیبات آنتی اکسیدان در شرایط درون شیشه این است که برخی از ترکیبات آنتی اکسیدان را می توان به سادگی از محصولات زراعی و باغی است استحصال نمود و حتی امروزه از ضایعات حاصل از صنایع ماءالشعیر وروغن گیری زیتون که بسیار ارزان قیمت هستند جهت استخراج ترکیبات آنتی اکسیدان استفاده می کنند. اگر چه می توان برخی از این ترکیبات را به آسانی از منابع مختلف در دسترس تولید نمود ولی به دلایل ذیل رویکرد ویژه‌ای به تولید آنها در شرایط درون شیشه است که اهم این دلایل عبارتند از:

  • نبود امکان تولید مصنوعی برخی از این ترکیبات به دلیل ساختار پیچیده آنها
  • ارزش اقتصادی بالا با آن که هزینه اولیه تولید بالا است ولی تجربه نشان داده است که در مدت زمان کوتاهی جبران می گردد.
  • میزان ناکافی این ترکیبات در منابع گیاهی
  • محدودیت استفاده از منابع گیاهی در رابطه با گیاهان کمیاب ، در حال انقراض و گیاهانی که به صورت بی رویه از طبیعت برداشت می شوند
  • استخراج و خالص سازی این ترکیبات از کشت های درون شیشه آسان تر است
  • تولید ترکیبات جدیدی که تاکنون در گیاه مورد نظر وجود نداشته اند
  • تولید در مقیاس صنعتی به طوری که بتواند نیاز صنایع داروسازی و غذایی را تأمین کند به طور مثال به وسیله بیوراکتورها
  • عدم وابستگی به عوامل محیطی و فصول مختلف سال
  • امکان کنترل بیشتر و راحتتر مسیرهای بیوسنتز این ترکیبات

از استراتژی های افزایش تولید ترکیبات آنتی اکسیدان در شرایط درون شیشه ای:

افزایش بیوسنتز آنتی اکسی